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간단한 설명:
2.1. SDE의 준비
SD의 뿌리줄기는 한허브(구리, 한국)에서 건조된 약초로 구입하였다. 식물재료는 한국한의학연구원(KIOM) 최고야 박사에 의해 분류학적으로 확인되었습니다. 바우처 표본(번호 2014 SDE-6)은 한국표준약초자원표본관에 기탁되었습니다. SD의 건조된 뿌리줄기(320g)를 70% 에탄올로 2회 추출하고(2시간 환류) 추출물을 감압 하에 농축했습니다. 달인 액을 여과하고 동결건조한 후 4°C에 보관했습니다. 조 출발 물질로부터 건조된 추출물의 수율은 48.13%(w/w)였습니다.
2.2. 정량적 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석
크로마토그래피 분석은 HPLC 시스템(Waters Co., Milford, MA, USA)과 포토다이오드 어레이 검출기를 사용하여 수행되었습니다. SDE의 HPLC 분석을 위해 prim-O-glucosylcimifugin 표준품은 한국전통의약산업진흥원(경산)에서 구입하였고,초-O-글루코실하마우돌 및 4'-O-β-D-글루코실-5-O-methylvisamminol은 우리 실험실 내에서 분리되었으며 주로 NMR 및 MS에 의한 스펙트럼 분석으로 확인되었습니다.
SDE 샘플(0.1 mg)을 70% 에탄올(10 mL)에 용해시켰습니다. 크로마토그래피 분리는 XSelect HSS T3 C18 컬럼(4.6 × 250mm, 5μm, Waters Co., Milford, MA, USA). 이동상은 1.0mL/분의 유속으로 물(B)에 용해된 아세토니트릴(A)과 0.1% 아세트산으로 구성되었습니다. 다단계 그라데이션 프로그램은 다음과 같이 사용되었습니다: 5% A(0분), 5~20% A(0~10분), 20% A(10~23분), 20~65% A(23~40분) ). 검출 파장은 210-400 nm에서 스캔되고 254 nm에서 기록되었습니다. 주입량은 10.0μL. 세 가지 크로몬 측정을 위한 표준 용액을 최종 농도 7.781 mg/mL로 제조했습니다(초-O-글루코실시미푸진), 31.125mg/mL(4'-O-β-D-글루코실-5-O-메틸비사미놀) 및 31.125mg/mL(초-O-glucosylhamaudol)을 메탄올에 넣고 4°C에서 보관합니다.
2.3. 항염증 활성 평가시험관 내
2.3.1. 세포 배양 및 시료 처리
RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 1% 항생제와 5.5% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양했습니다. 세포를 37°C, 5% CO2의 습한 대기에서 배양했습니다. 세포를 자극하기 위해 배지를 새로운 DMEM 배지로 교체하고 지질다당류(LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 1에서 교체하였다.μSDE(200 또는 400) 존재 또는 부재 하에 g/mL를 첨가했습니다.μg/mL)을 추가로 24시간 동안 추가합니다.
2.3.2. 산화질소(NO), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 종양 괴사 인자 측정-α(TNF-α) 및 인터루킨-6(IL-6) 생산
세포를 SDE로 처리하고 LPS로 24시간 동안 자극하였다. 이전 연구에 따르면 Griess 시약을 이용하여 아질산염을 측정하여 NO 생성을 분석하였다.12]. 염증성 사이토카인 PGE2, TNF-의 분비αIL-6은 제조업체 지침에 따라 ELISA 키트(R&D 시스템)를 사용하여 결정되었습니다. NO 및 사이토카인 생산에 대한 SDE의 효과는 Wallac EnVision을 사용하여 540 nm 또는 450 nm에서 측정되었습니다.™마이크로플레이트 리더(PerkinElmer)
2.4. 항골관절염 활성 평가생체 내
2.4.1. 동물
수컷 Sprague-Dawley 쥐(7주령)를 Samtako Inc.(대한민국 오산)에서 구입하여 12시간 명암 주기로 통제된 조건에서 사육했습니다.°C 및% 습도. 쥐에게 실험용 사료와 물을 제공했습니다.자유롭게. 모든 실험 절차는 국립보건원(NIH) 지침에 따라 수행되었으며 대전대학교 동물 관리 및 사용 위원회(대한민국 대전)의 승인을 받았습니다.
2.4.2. 쥐에서 MIA를 이용한 OA 유도
연구 시작 전에 동물을 무작위로 나누어 치료군에 배정했습니다.그룹당). MIA 용액(3mg/50μ0.9% 식염수 L)을 케타민과 자일라진의 혼합물로 유도된 마취 하에 오른쪽 무릎의 관절강 내로 직접 주사하였다. 쥐를 무작위로 4개 그룹으로 나누었습니다: (1) MIA를 주사하지 않은 식염수 그룹, (2) MIA를 주사한 MIA 그룹, (3) MIA를 주사한 SDE 처리군(200mg/kg), (4) ) 인도메타신-(IM-) 처리군(2mg/kg)과 MIA 주사. 쥐에게 MIA 주입 1주 전 4주 동안 SDE와 IM을 경구 투여했습니다. 본 연구에 사용된 SDE 및 IM의 용량은 이전 연구에서 사용된 용량을 기준으로 했습니다.10,13,14].
2.4.3. 뒷발 체중 부하 분포 측정
OA 유도 후 뒷발의 체중 부하 능력의 원래 균형이 중단되었습니다. 인캐패시턴스 테스터(Linton Instrumentation, Norfolk, UK)를 사용하여 체중 부하 허용 오차의 변화를 평가했습니다. 쥐를 조심스럽게 측정 챔버에 넣었습니다. 뒷다리에 의해 가해지는 체중 부하력은 3초 동안 평균화되었습니다. 체중분배율은 [오른쪽 뒷다리 체중/(오른쪽 뒷다리 체중 + 왼쪽 뒷다리 체중)] × 100 [15].
2.4.4. 혈청 사이토카인 수준 측정
혈액 샘플을 4°C에서 10분간 1,500g으로 원심분리했습니다. 그런 다음 혈청을 수집하고 사용할 때까지 -70°C에서 보관했습니다. IL-1의 수준β, IL-6, TNF-α, 혈청 내 PGE2는 제조업체 지침에 따라 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)의 ELISA 키트를 사용하여 측정되었습니다.
2.4.5. 실시간 정량적 RT-PCR 분석
TRI 시약®(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 무릎 관절 조직에서 총 RNA를 추출하고 cDNA로 역전사한 다음 SYBR 녹색이 포함된 TM One Step RT PCR 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 PCR 증폭했습니다. , 미국 뉴욕 주 그랜드 아일랜드). 실시간 정량 PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 프라이머 서열과 프로브 서열은 표에 나와 있습니다.1. 샘플 cDNA의 분취량과 동일한 양의 GAPDH cDNA를 제조업체 지침(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)에 따라 DNA 폴리머라제를 포함하는 TaqMan® Universal PCR 마스터 혼합물을 사용하여 증폭시켰습니다. PCR 조건은 50°C에서 2분, 94°C에서 10분, 95°C에서 15초, 60°C에서 1분으로 40주기였습니다. 표적 유전자의 농도는 제조업체 지침에 따라 비교 Ct(증폭 플롯과 역치 사이의 교차점에서의 역치 사이클 수) 방법을 사용하여 결정되었습니다.
골관절염(OA)은 가장 빈번한 근골격계 질환이며, 노년층에서 가장 흔한 퇴행성 관절질환이다.1]. OA는 부상, 연골 구조 및 기능의 상실, 전염증 및 항염증 경로의 조절 장애로 인해 부분적으로 발생하는 질환입니다.2,3]. 주로 윤활관절의 관절연골과 연골하골에 영향을 미치고 관절부전을 초래하여 걷거나 서 있는 등 체중부하 시 통증을 유발한다.4].
골관절염은 한번 파괴된 연골을 회복하기가 매우 어렵기 때문에 치료법은 없습니다.5]. 치료의 목표는 통증을 완화하고, 관절 이동성을 유지 또는 개선하고, 관절의 강도를 높이고, 질병으로 인한 장애 효과를 최소화하는 것입니다. OA의 약리학적 치료는 환자의 관절 기능과 삶의 질을 향상시키기 위해 통증을 줄이는 것을 목표로 합니다. 골관절염의 주요 사건은 연골 파괴이지만, 콜라겐의 분해는 염증과 관련된 골관절염의 비가역적 진행을 결정하는 근본적인 사건이다.6,7]. 항염증 및 연골 보호 활성을 이용한 치료는 OA 환자의 통증을 완화하고 매트릭스 무결성을 유지할 것으로 예상됩니다.
따라서 염증을 줄이는 것이 OA 관리에 도움이 될 것입니다. 최근 연구에서는 관절 관련 조직과 상호 작용하여 관절 통증을 완화시키는 능력을 통해 연골 세포 염증 및 추가 연골 파괴를 완화하는 측면에서 골관절염 진행에 대한 약초 자원의 보호 역할을 제안합니다.8].
루트사포시니코비아 디바리카타시쉬킨(Schischkin, Umbelliferae)은 한국과 중국에서 두통, 통증, 염증, 관절염 치료를 위해 전통의학에서 널리 사용되어 왔습니다.9,10]. 다양한 약리학적 효과사포시니코비아 디바리카타(SD)에는 또한 항염증제, 진통제, 해열제 및 항관절염 특성이 포함됩니다.9,11]. 최근 연구에 따르면 SD 크로몬 추출물은 콜라겐 유발 관절염 마우스 모델에서 잠재적인 항류마티스 관절염 효과를 가지고 있는 것으로 나타났습니다.10]; 그러나 항염증 및 항관절염 활성을 뒷받침하는 연구는 거의 수행되지 않았습니다.사포시니코비아 디바리카타추출 (SDE).
따라서 본 연구에서는 SD의 70% 에탄올 추출물의 항염증 및 항골관절염 활성을 조사하였다. 먼저 SDE의 항염증 효과를 평가하였다.시험관 내에서LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서. 다음으로, SDE의 항골관절염 효과는 요오드아세트산 모노나트륨(MIA-) 유도 OA의 쥐 모델에서 체중 부하 분포, 관절 연골의 분해 및 염증 반응을 평가함으로써 측정되었습니다.
