크로마토그래피 분석은 HPLC 시스템(Waters Co., Milford, MA, USA)과 광전 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 수행되었다. SDE의 HPLC 분석을 위해,O-glucosylcimifugin 표준은 한국전통의학산업진흥원(경산, 한국)에서 구입했습니다.초-O-글루코실하마우돌 및 4'-O-β-D-글루코실-5-O-메틸비사미놀은 우리 연구실에서 분리되었으며, 주로 NMR과 MS를 이용한 스펙트럼 분석을 통해 식별되었습니다.
SDE 시료(0.1 mg)를 70% 에탄올(10 mL)에 용해시켰다. 크로마토그래피 분리는 XSelect HSS T3 C18 컬럼(4.6 × 250 mm, 5μm, Waters Co., Milford, MA, USA). 이동상은 아세토니트릴(A)과 0.1% 아세트산을 1.0 mL/min의 유속으로 물에 녹인 것(B)으로 구성되었다. 다단계 구배 프로그램은 다음과 같이 사용되었다: 5% A(0분), 5~20% A(0~10분), 20% A(10~23분), 그리고 20~65% A(23~40분). 검출 파장은 210~400 nm에서 스캔하고 254 nm에서 기록하였다. 주입량은 10.0 mL였다.μL. 3개의 크로몬을 결정하기 위한 표준 용액은 최종 농도 7.781 mg/mL(prim-)로 준비되었습니다.O-글루코실시미푸긴), 31.125 mg/mL (4'-O-β-D-글루코실-5-O-메틸비사미놀), 및 31.125 mg/mL(초-O-글루코실하마우돌)을 메탄올에 넣고 4°C에 보관했습니다.
2.3. 항염증 활성 평가시험관내
2.3.1. 세포 배양 및 시료 처리
RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 입수하여 1% 항생제와 5.5% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 배양했습니다. 세포를 37°C, 5% CO2의 가습 환경에서 배양했습니다. 세포를 자극하기 위해 배지를 새로운 DMEM 배지로 교체하고, 1% 리포폴리사카라이드(LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 첨가했습니다.μg/mL은 SDE(200 또는 400)의 존재 또는 부재 하에 첨가되었습니다.μ추가 24시간 동안 (g/mL)
2.3.2. 일산화질소(NO), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 종양괴사인자(TNF)의 측정α(TNF-α), 및 인터루킨-6(IL-6) 생산
세포는 SDE로 처리하고 LPS로 24시간 동안 자극했습니다. NO 생성은 이전 연구에 따라 Griess 시약을 사용하여 아질산염을 측정하여 분석했습니다. [12]. 염증성 사이토카인 PGE2, TNF-의 분비αIL-6는 제조사의 지침에 따라 ELISA 키트(R&D systems)를 사용하여 측정했습니다. SDE가 NO 및 사이토카인 생성에 미치는 영향은 Wallac EnVision을 사용하여 540nm 또는 450nm에서 측정했습니다.™마이크로플레이트 리더(PerkinElmer).
2.4. 항골관절염 활성 평가생체 내
2.4.1. 동물
수컷 Sprague-Dawley 쥐(7주령)를 Samtako Inc.(오산, 한국)에서 구입하여 12시간 낮/어둠 주기를 갖는 조절된 환경에서 사육했습니다.°C 및습도 %. 쥐들에게는 실험실용 사료와 물이 제공되었습니다.자유롭게모든 실험 절차는 미국 국립보건원(NIH)의 지침을 준수하여 수행되었으며 대전대학교(대전, 대한민국) 동물실험관리위원회의 승인을 받았습니다.
2.4.2. 쥐에서 MIA를 이용한 OA 유도
동물들은 연구 시작 전에 무작위로 배정되어 치료 그룹에 배정되었습니다.그룹당). MIA 용액(3 mg/50μ0.9% 식염수(L)를 케타민과 자일라진 혼합액으로 마취 유도 하에 오른쪽 무릎 관절 내 공간에 직접 주입했습니다.쥐를 무작위로 4개 그룹으로 나누었습니다: (1) MIA 주사를 하지 않은 식염수 그룹, (2) MIA 주사를 한 MIA 그룹, (3) MIA 주사를 한 SDE-처리 그룹(200 mg/kg), (4) MIA 주사를 한 인도메타신-(IM-) 처리 그룹(2 mg/kg).쥐에게 MIA 주사 1주일 전 4주 동안 SDE와 IM을 경구 투여했습니다.이 연구에서 사용된 SDE와 IM의 용량은 이전 연구에서 사용된 용량을 기반으로 했습니다.10,13,14].
2.4.3. 뒷발 체중부하 분포 측정
OA 유도 후, 뒷발의 체중 지지 능력의 원래 균형이 깨졌습니다. 체중 지지 내성의 변화를 평가하기 위해 무능력 시험기(Linton instrumentation, Norfolk, UK)를 사용했습니다. 쥐를 측정 챔버에 조심스럽게 넣었습니다. 뒷다리가 가하는 체중 지지력을 3초 동안 평균화했습니다. 체중 분배 비율은 다음 방정식으로 계산했습니다. [오른쪽 뒷다리의 체중/(오른쪽 뒷다리의 체중 + 왼쪽 뒷다리의 체중)] × 100 [15].
2.4.4. 혈청 사이토카인 수치 측정
혈액 샘플을 4°C에서 1,500g로 10분간 원심분리한 후 혈청을 채취하여 사용할 때까지 -70°C에 보관했습니다. IL-1 수치는β, IL-6, TNF-α, 혈청 내 PGE2는 제조업체의 지침에 따라 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)의 ELISA 키트를 사용하여 측정했습니다.
2.4.5. 실시간 정량 RT-PCR 분석
무릎 관절 조직에서 TRI 시약®(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출하고, cDNA로 역전사시킨 후, SYBR green(Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA)을 첨가한 TM One Step RT PCR 키트를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 실시간 정량 PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA)을 사용하여 수행하였다. 프라이머 서열과 프로브 서열은 표에 제시되어 있다.1샘플 cDNA 분취량과 동량의 GAPDH cDNA를 제조사(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)의 지침에 따라 DNA 중합효소가 포함된 TaqMan® Universal PCR 마스터 혼합물을 이용하여 증폭시켰다. PCR 조건은 50°C에서 2분, 94°C에서 10분, 95°C에서 15초, 그리고 60°C에서 1분 동안 40회 반복하였다. 표적 유전자의 농도는 제조사의 지침에 따라 비교 Ct(증폭 플롯과 역치의 교차점에서의 역치 사이클 수) 방법을 사용하여 측정하였다.
골관절염(OA)은 노인에서 가장 흔한 근골격계 질환이자 가장 흔한 퇴행성 관절 질환입니다.1]. OA는 부분적으로 부상, 연골 구조 및 기능 상실, 염증성 및 항염증성 경로의 조절 장애로 인해 발생하는 상태입니다.2,3]. 주로 활막 관절의 관절 연골과 연골하 뼈에 영향을 미치며 관절 기능 부전을 초래하여 걷기와 서기를 포함한 체중 부하 시 통증을 유발합니다. [4].
OA의 치료법은 없습니다. 연골이 파괴되면 이를 복구하는 것이 매우 어렵기 때문입니다.5]. 치료의 목표는 통증 완화, 관절 운동성 유지 또는 개선, 관절 강도 증가, 그리고 질환으로 인한 장애 발생 최소화입니다. OA의 약리학적 치료는 환자의 관절 기능과 삶의 질을 향상시키기 위해 통증을 줄이는 것을 목표로 합니다. 연골 파괴가 OA의 주요 원인이지만, 콜라겐 분해는 염증과 함께 OA의 비가역적 진행을 결정하는 근본적인 요인입니다.6,7]. 항염증 및 연골 보호 활성을 지닌 치료는 OA 환자의 통증을 완화하고 기질의 완전성을 유지하는 데 도움이 될 것으로 기대됩니다.
따라서 염증을 감소시키는 것은 골관절염 관리에 유익할 것으로 예상됩니다. 최근 연구에 따르면, 한약은 관절 관련 조직과 상호작용하여 관절 통증을 완화함으로써 연골세포 염증과 연골 파괴를 완화하는 등 골관절염 진행에 대한 보호 역할을 하는 것으로 나타났습니다.8].
의 뿌리사포시니코비아 디바리카타Schischkin(Umbelliferae)은 한국과 중국에서 두통, 통증, 염증 및 관절염 치료를 위해 전통 의학에서 널리 사용되었습니다.9,10]. 다양한 약리학적 효과사포시니코비아 디바리카타(SD)에는 항염, 진통, 해열 및 항관절염 특성도 포함됩니다.9,11]. 최근 연구에 따르면 SD 크로몬 추출물은 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 잠재적인 항류마티스 관절염 효과를 가지고 있음이 입증되었습니다. [10]; 그러나 항염증 및 항관절염 활동을 뒷받침하기 위해 수행된 연구는 거의 없습니다.사포시니코비아 디바리카타추출물(SDE).
따라서 본 연구에서는 SD 70% 에탄올 추출물의 항염증 및 항골관절염 활성을 조사하였다. 먼저, SDE의 항염증 효과를 평가하였다.시험관 내에서LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서. 다음으로, 요오드아세트산나트륨(MIA)으로 유도된 골관절염 랫드 모델에서 체중 부하 분포, 관절 연골 분해, 그리고 염증 반응을 평가하여 SDE의 항골관절염 효과를 측정하였다.
